盘点常见的E3泛素连接酶配体

蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）是一类催化异双功能分子，这些分子通过一个连接子（linker）同时结合内源性效应物和感兴趣的靶蛋白（POI），它们的功能是使这两种蛋白质互相靠近，从而发挥作用。PROTAC能够通过招募泛素E3连接酶到靶标上，选择性地降解特定的蛋白质。这种作用导致靶蛋白的泛素化，并最终被蛋白酶体降解。

泛素化是一种通过添加小调节蛋白分子泛素来对蛋白质赖氨酸残基进行共价修饰的过程。这个过程需要三种酶：ATP依赖性泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）。泛素首先从E1转移到E2上的催化半胱氨酸，形成硫酯连接的缀合物。然后，E2-泛素缀合物与E3结合，它们共同将泛素从E2转移到靶蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基上。在许多情况下，E3内的RING结构域是E2的相互作用位点，RING结构域的存在通常被认为是E3泛素连接酶功能的标志。

泛素连接酶E3在调节许多生物过程中起着重要作用，其异常表达常导致某些疾病的发生。由于E3连接酶通常是大型多亚基或多结构域蛋白，催化两种蛋白质之间的连接反应，因此E3连接酶被认为是“不可成药”的靶标。这使得E3连接酶配体的开发具有挑战性，因为E3连接酶缺乏常规成药靶标中发现的可配体活性位点，如蛋白激酶和G蛋白偶联受体（GPCR）。相反，与E3连接酶的结合必须涉及靶向蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）或其他浅层蛋白质表面或界面。

尽管人类细胞中有 600 多种类型的 E3 连接酶，但只有非常有限数量的 E3 连接酶被用于 PROTAC 技术。常见的E3 连接酶的配体包括VHL（Von Hippel-Lindau 底物受体亚基）和 CRBN（Cereblon）、MDM2（鼠双微体2）、cIAP（细胞凋亡抑制剂）、RNF4和RNF114（RING型锌指蛋白）、DDB1（损伤特异性 DNA 结合蛋白 1）、DCAF11和DCAF16（Cul4 相关因子 11 和 16）、KEAP1（Kelch 样 ECH 相关蛋白 1）。迄今为止，开发的大多数 PROTAC 仅限于 CRBN 或 VHL，这两种在人体内普遍存在并表达。

VH032-cyclopropane-F是基于VH032的VHL配体。它可以通过连接子与靶蛋白配体连接，形成PROTAC分子。

PROTAC砌块是指用于合成PROTAC类分子的Linker单元，泛素连接酶E3配体单元。筑药网开发了超过600种的Linker和E3连接酶配体砌块，涵盖了常见的长碳链，乙二醇长链，螺杂环链，CRBN、VHL、cIAP和MDM2配体等多种化学结构。

VHL配体

Von Hippel-Lindau （VHL） 基因于 1993 年通过位置克隆首次被发现。它与VHL病有关，VHL病是一种常染色体显性遗传病，由VHL中的种系失活突变引起，易患各种类型的肿瘤，如视网膜血管瘤病和血管母细胞瘤，其他通常与VHL疾病相关的癌症是透明细胞肾细胞癌（ccRCC）和嗜铬细胞瘤（PCC），以及其他肾脏、附睾和胰腺肿瘤。

Von Hippel-Lindau （VHL） 蛋白是 Cullin 2 E3连接酶的底物受体蛋白。缺氧诱导因子 1α （HIF-1α） 是 VHL 的底物蛋白之一。VHL肿瘤抑制因子与转录因子 Elongin-C 和 Elongin-B 结合形成 VHL-elongin-C-elongin-B 蛋白复合物并发挥其功能，例如降解缺氧诱导因子。VHL 配体可用于调节 VHL-HIF1α 相互作用并调节缺氧信号通路，具有用于慢性贫血或缺血治疗的潜在应用。VHL 配体 VH032 ( 1 ) 和 VH298 ( 2 ) 是羟脯氨酸 (Hyp) 衍生物，HIF-1α 的 Hyp564 对于其与 VHL 的相互作用至关重要。

VCB晶体结构（PDB 1VCB）（a），与VCB结合的HIF-1α肽（PDB 1LM8）的共晶结构（b），以及全长 VCB-Cul2-Rbx1 多域复合体 （PDB 5N4W） 的结构 （c）^[2]。

一组 VHL 配体的结构^[3]。

而且VHL 配体还广泛用于构建二价分子，例如蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)，以降解蛋白质以用于潜在的治疗应用。针对VHL的高亲和力和高特异性小分子配体的开发，为PROTACs的设计提供了关键知道。基于 VHL 的灵敏和选择性结合测定，对于通过高通量筛选方法来识别和表征 VHL 配体至关重要。

VH032和VH298是作为VHL的化学抑制剂，在组学研究中得到了应用。VH032-cyclopropane-F 是一种基于 VH032 的 VHL 配体。VH032-cyclopropane-F 可以通过 连接子（linker） 与靶蛋白配体 (比如 SMARCA BD 配体) 连接，形成 PROTAC 分子 (比如 PROTAC 1)，PROTAC 1 是 SMARCA2 和 SMARCA4 的部分降解剂。

筑药网提供高纯度的VH032-cyclopropane-F中间体，CAS号为2306193-99-5，分子式为C₂₆H₃₃FN₄O₅S，满足医药研发工作者的科研需求。

VH032-cyclopropane-F

CRBN配体

CRBN配体常用的有3类，一是基于泊马度胺的配体，二是基于4-羟基酞胺的配体，三是基于来那度胺的配体。在 1950 年代，沙利度胺最初作为孕妇孕吐的镇静剂。然而，由于其在1960年代初因其严重的致畸作用，沙利度胺被撤出市场。在接下来的几十年里，沙利度胺被经过广泛研究，重新定位于一种有潜力的免疫调节酰亚胺药物（IMiD），并获批准用于治疗麻风结节性红斑（ENL）和多发性骨髓瘤。沙利度胺的衍生物，如泊马度胺和来那度胺，在治疗多发性骨髓瘤方面显示出显著的疗效。

目前PROTACs和分子胶主要使用的CRBN配体仍然是免疫调节抑制剂，如来那度胺（Lenalidomide），沙利度胺（Thalidomide）和泊马度胺（Pomalidomide）。但是这些化合物都会存在一些缺陷，如易消旋和易降解neosubstrate等，所以人们一直在开发新型的CRBN配体。

泊马度胺

IAP配体

细胞凋亡蛋白抑制剂 （IAP） 是细胞死亡的调节因子，它们控制由多种刺激触发的凋亡事件。目前发现的该蛋白家族成员有NAIP、c-IAP1、c-IAP2、XIAP、Survivin、Bruce、ILP-2 和 Livin。

在2007 年，Vucic小组开发了一种细胞凋亡 1 和 2（c-IAP1 和 c-IAP2）拮抗剂 （MV1） 抑制剂，该抑制剂与 IAP 蛋白的杆状病毒 IAP 重复序列 （BIR） 结构域结合，导致 c-IAP 的自泛素化和蛋白酶体降解 （KD= 5.8 nM）.MV1降解c-IAPs诱导TNF信号通路依赖性细胞死亡。

Sekine等人报道了一种不同的c-IAP1配体，即bestatin-methylester（ME-BS），它与cIAP1的BIR3结构域结合并诱导自泛素化，随后导致cIAP1的蛋白酶体降解。Itoh等人使用上述两种配体开发了双功能小分子。

在2020 年，葛兰素史克公司报道了一种基于 palbociclib 的 PROTAC，该 PROTAC 具有 CRBN 配体、VHL 配体和 IAP 结合剂，用于降解 CDK4 和 CDK6。他们使用各种连接子将三种不同的 E3 连接酶配体与 palbociclib（一种 FDA 批准的抗乳腺癌药物）偶联。

MDM2配体

（MDM2） 蛋白是一种 E3 泛素连接酶，可调节 p53 的泛素化和随后的 p53 蛋白酶体降解。在2004 年，罗氏报道了一种有效的选择性 MDM2-p53 相互作用的小分子抑制剂。Idasanutlin (RG7388) 是一种有效，选择性的 MDM2 拮抗剂，能够抑制 p53-MDM2 的结合，IC50 值为 6 nM。

DCAF配体

磺胺类衍生物因其抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性而受到关注。研究报告称，磺胺衍生物靛苏仑 （41）、E7820 （42） 和氯喹喔啉磺酰胺 （CQS， 43） 作为分子胶，诱导 E3 连接酶和靶蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。

报道中提到的DCAF配体的化学结构^[4]。

据报道，Novartis公司的科学家证明了基于DCAF1作为E3连接酶配体的PROTAC，能够成功诱导BRD9蛋白和BTK蛋白的降解。研究者使用他们新开发的DCAF1配体13作为E3泛素连接酶配体，设计了多种蛋白降解剂，这些降解剂都能够快速、高效地诱导靶蛋白的降解。同时也证明了这一降解过程是通过泛素-蛋白酶体系统实现的，这增加了可用的E3泛素连接酶配体数量，拓展了PROTAC的应用范围。

此外E3泛素连接酶配体还有RNF配体、AhR配体、FEM1B配体、KEAP1配体等，这里不一一列举。

在真核细胞中，泛素-蛋白酶体负责蛋白质的降解，决定着蛋白质的最终命运。其中E3泛素连接酶决定着泛素-蛋白酶体系降解蛋白的特异性。因此探索更多的E3连接酶功能性配体分子，有助于在源头上实现差异化的蛋白降解剂开发。

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参考文献:

[1] Mendoza M, Mandani G, Momand J. The MDM2 gene family. Biomol Concepts. 2014 Mar;5(1):9-19. doi: 10.1515/bmc-2013-0027. PMID: 25372739; PMCID: PMC4221809.

[2] Cardote T. A. F. Gadd M. S. Ciulli A. Structure. 2017;25:901–911.e3. doi: 10.1016/j.str.2017.04.009.

[3] Lin W, Li Y, Yang L, Chen T. Development of BODIPY FL VH032 as a High-Affinity and Selective Von Hippel-Lindau E3 Ligase Fluorescent Probe and Its Application in a Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy-Transfer Assay. ACS Omega. 2020 Dec 29;6(1):680-695. doi: 10.1021/acsomega.0c05221. PMID: 33458521; PMCID: PMC7807814.

[4] Lee J, Lee Y, Jung YM, Park JH, Yoo HS, Park J. Discovery of E3 Ligase Ligands for Target Protein Degradation. Molecules. 2022 Oct 2;27(19):6515. doi: 10.3390/molecules27196515. PMID: 36235052; PMCID: PMC9573645.